|
 |
|
Fasciculochloris boldii (Chlorophyceae, Chlorophyta) в почвах России
Темралеева А.Д., Москаленко С.В., Портная Е.А. Anna D. Temraleeva, Svetlana V. Moskalenko, Elena A. Portnaya
Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (Пущино, Россия)
УДК 582.263
По данным 18S рРНК- и ITS2-анализов штаммы ACSSI 006, 008, 019, 021, 055 из серой лесной почвы Московской области и ACSSI 172, 173, 174 из солонцов Волгоградской области идентифицированы как Fasciculochloris boldii. Все штаммы характеризовались морфологическими признаками, типичными для рода Fasciculochloris: способностью к десмосхозису, наличием пристенного хлоропласта с одним пиреноидом и зооспор с двумя слегка неравными по длине жгутиками. От типового диагноза штаммы ACSSI отличались полым шаровидным, а не чашевидным хлоропластом, и отсутствием многоклеточных пакетов. Генетические различия внутри клады Fasciculochloris на 18S рРНК-дереве составляли от 0,1 до 0,3%, на ITS2-дереве — от 0 до 3,4%. Все представители рода имели длину ITS2 равную 238–240 нуклеотидов и одинаковый консервативный мотив AGCUGGGUAGGU III шпильки ITS2, отличный от других близкородственных таксонов. Компенсаторные замены в консервативных регионах ITS2 отсутствовали, что позволило отнести все перечисленные штаммы к одному виду – F. boldii. Таким образом, впервые в серых лесных почвах и солонцах России были обнаружены находки зеленой водоросли F. boldii, подтвержденные с помощью морфологического и молекулярно-генетического анализов. Ключевые слова: зеленые водоросли; морфология; 18S рРНК; ITS2; почвы; ACSSI.
Введение Род Fasciculochloris McLean, Trainor был описан в 1965 году на основании штамма F. boldii UTEX 1451, выделенного из почвы кукурузного поля штата Коннектикут, США (McLean, Trainor, 1965). Данный род включает в себя всего два вида: типовой – F. boldii и F. mexicana Flechtner, Johansen, Clark. Последний был описан в 1998 году на основании штамма UTEX 2682, изолированного из биотических корочек Нижнекалифорнийской пустыни, Мексика (Flechtner et al., 1998). Новый вид был выделен благодаря различиям в размерах зооспор и обильному выделению слизи. В зарубежных и отечественных альгологических списках представители рода упоминаются крайне редко (Freshwater …, 2003; GBIF, 2018), возможно потому, что главный диагностический признак – зооспоры со жгутиками слегка неравной длины (различия около 10%) – сложно определить визуально, без фиксации клеток и их измерения. Целью данного исследования стала морфологическая и молекулярно-генетическая идентификация восьми коллекционных штаммов зеленой водоросли F. boldii, выделенных из серой лесной почвы и солонцов России.
Материалы и методы Изоляция и культивирование штаммов водорослей. Объектами данного исследования стали восемь диких штаммов зеленых водорослей вида Fasciculochloris boldii, депонированные в Альгологическую коллекцию ACSSI (http://acssi.org) под номерами 006, 008, 019, 021, 055, 172, 173 и 174. Штаммы 006, 008, 019, 021 и 055 были получены из почвенно-альгологических проб, отобранных из горизонта A1 серой лесной почвы Московской области (54°50'03'' с.ш., 37°34'24'' в.д.). Штаммы ACSSI 172, 173 и 174 были изолированы из горизонта А1 солонцов Волгоградской области (47°53'21" с.ш., 44°0'50" в.д.). Почвенную суспензию высеивали на твердую питательную среду BG11 с азотом (1% агар, pH=7,0) и культивировали в климатостате в стандартных условиях (температура +23–25ºС, свет 60–75 μмоль фотонов•м-2•с-1, фотопериод 12 ч). Отдельные колонии водорослей многократно пересевали методом истощающего штриха. Микроскопия. Изучение морфологии и жизненных циклов штаммов проводили методами световой микроскопии (светлое поле и интерференционный контраст) с помощью микроскопов Leica DM750 «Leica microsystems» и Carl Zeiss Axio Scope A1 «Carl Zeiss Microscopy GmbH» (Германия) в ЦКП ИФХиБПП РАН. Результаты наблюдений документировали рабочими рисунками и фотографиями, снятыми с помощью цветных цифровых камер «Видеозавр» (Россия) и Carl Zeiss MRc 5 (Германия). Для таксономической идентификации проводили несколько прижизненных цитохимических реакций: на крахмал – раствором Люголя, на слизь – 1%-ным раствором туши. Сроки наблюдения за штаммами составляли от 12 часов до 6 месяцев. Выделение, амплификация, очистка и секвенирование ДНК. ДНК выделяли из биомассы зеленых водорослей с помощью набора DNeasy Plant Mini Kit «Qiagen» (США), следуя протоколу производителя. При амплификации использовали готовую смесь для ПЦР Screen Mix-HS «Евроген» (Россия). Для амплификации гена 18S рРНК были выбраны праймеры и условия из статьи Katana с соавт. (2001), для ITS2 использовали универсальные праймеры из статьи White с соавт. (1990) с оптимизированными условиями ПЦР: 95ºC – 3 мин.; 95ºC – 30 сек., 57,6ºC – 30 сек., 72ºC – 1 мин., 35 циклов; 72ºC – 10 мин. Детекцию целевых ПЦР-продуктов проводили электрофоретически в 1%-ном агарозном геле. Для дальнейшей очистки ампликонов из геля применяли набор Cleanup Mini «Евроген» (Россия). Секвенирование нуклеотидных последовательностей осуществляли на базе ЗАО «Синтол» (Россия). Молекулярно-филогенетический анализ. Для молекулярно-филогенетического анализа была составлена выборка из 30 последовательностей гена 18S рРНК и ITS2 штаммов зеленых водорослей, относящихся к роду Fasciculochloris и близкородственных таксонов, которая включала собственные данные и данные GenBank (табл. 1). Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполняли в программе BioEdit по алгоритму ClustalW. При наличии интрона в гене 18S рРНК он был удален (последовательность X91268). Для выбора модели нуклеотидных замен использовали программу jModelTest. Для обоих маркеров оптимальной стала модель GTR+I+G. Реконструкцию филогенетических взаимосвязей осуществляли методом максимального правдоподобия (ML) в программе PhyML. В качестве внешней группы выбрали представителя другого порядка Sphaeropleales – Pseudomuriella aurantiaca. Статистическая поддержка топологии деревьев была оценена с помощью бутстреп-анализа (1000 повторностей) и указана в узлах ветвей. Вычисление генетических дистанций проводили в программе MEGA 5.0. Для анализа вторичной структуры ITS2 была выполнена аннотация спейсера в ITS2-DataBase (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de), его фолдинг с помощью веб-сервера mfold (http://unafold.rna.albany.edu); сравнение вторичной структуры между штаммами, поиск консервативных мотивов и компенсаторных замен осуществляли в программе 4SALE. В качестве инструмента разделения видов использовали подход, предложенный A. Coleman (2000, 2009), которая показала, что наличие хотя бы одной компенсаторной замены в консервативных регионах ITS2 (10 пар нуклеотидов для II шпильки и 18 пар – для III шпильки) у двух водорослей коррелирует с их полной половой несовместимостью. Напротив, замены в менее консервативных регионах (I и IV шпильки), а также полукомпенсаторные замены в консервативных регионах не были связаны со способностью скрещиваться. На основе мета-анализа большого числа данных Müller с соавт. (2007) установили, что наличие даже 1 компенсаторной замены в 93% исследованных случаев указывает на принадлежность организмов к разным видам. Напротив, замены в менее консервативных регионах (I и IV шпильки), а также полукомпенсаторные замены в консервативных регионах не были связаны со способностью скрещиваться. При оценке правильности фолдинга ITS2 мы ориентировались на работу Caisová с соавт. (2013).
Таблица 1. Список штаммов, использованных в филогенетическом анализе рода Fasciculochloris и близкородственных таксонов [при нажатии на ссылку открывается полный текст таблицы]
Результаты и обсуждение Все изученные штаммы имели следующие морфологические признаки (рис. 1): клетки одиночные или в диадах и тетрадах, более сложные комплексы отсутствовали. Одиночные клетки от неправильно удлиненных до эллипсовидных и шаровидных. Диаметр шаровидных клеток до 11 мкм, эллипсовидные 5–14 х 4–9 мкм. Хлоропласт один, пристенный полый шаровидный. Пиреноид один с непрерывной крахмальной обверткой, крупный. Ядро одно, хорошо видимое. Бесполое размножение путем десмосхизиса и зооспорами. Пакеты в среднем 17–20 х 13–17 мкм, угловатые. Зооспоры с двумя жгутиками слегка неравной длины, не округляющиеся после остановки. Зооспоры по 4–8, в среднем до 7 мкм длиной, 4,5 мкм шириной, с двумя сократительными вакуолями, срединной или задней стигмой, одним пристенным хлоропластом и одним пиреноидом с непрерывной крахмальной обверткой. Половое размножение не наблюдалось. После 3–6 месяцев непрерывного культивирования приобретает светло-желто-оранжевый цвет и концентрическую слоистость слизистой оболочки. От описания типового вида F. boldii штаммы отличались полым шаровидным хлоропластом, а не чашевидным, и отсутствием многоклеточных пакетов (McLean, Trainor, 1965).
Рис. 1. Фотографии штаммов водорослей ACSSI Fasciculochloris boldii: зооспоры штаммов ACSSI 021 (a) и ACSSI 055 (b), вегетативные клетки штаммов ACSSI 006 (c) и ACSSI 008 (d), клеточные комплексы штаммов ACSSI 173 (e) и ACSSI 172 (f), вегетативные клетки в 3-месячной культуре штамма ACSSI 174 (g) и 6-месячной культуре штамма ACSSI 019 (h). Шкала 10 мкм
Изученные штаммы являются первыми находками зеленой водоросли F. boldii в почвах России, подтвержденными морфологическим и молекулярно-генетическим анализами. Данный вид часто встречается в солонцах и серых лесных почвах, но может ошибочно приниматься за другие виды при просмотре смешанных культур без дальнейшей очистки и получения монокультуры. Так, стадия зооспор Fasciculochloris может описываться как Chlamydomonas spp., одиночные вегетативные шаровидные клетки как представители родов Chlorococcum или Neochloris, клеточные комплексы как представители родов Tetracystis, Neochlorosarcina или Chlorosarcinopsis. Проведенный 18S рРНК-анализ объединил исследованные штаммы ACSSI с аутентичным штаммом F. boldii SAG 27.95 cо 100%-ной статистической поддержкой в одну группу (рис. 2).
Рис. 2. Укорененное филогенетическое дерево зеленых водорослей рода Fasciculochloris и близкородственных таксонов, построенное методом максимального правдоподобия (ML), на основе последовательностей гена 18S рРНК (1776 п.н.). Fig. 2. The rooted phylogenetic tree of green microalgal genus Fasciculochloris and closely related taxa constructed by maximal likelihood method (ML) for 18S rRNA gene sequence data (1776 bp).
Аутентичный штамм Chlamydomonas rapa f. vasta CCAP 11/73 и дикие штаммы Chlamydomonas inflexa NIES-2216 и Chlamydomonas rapa NIES-2234 заняли положение внутри рода Fasciculochloris. Внутригрупповые генетические различия в гене 18S рРНК составили 0,1–0,3%. Различия клады Fasciculochloris от близкородственных таксонов, сформировавших группу с 88%-ной статистической поддержкой, Heterotetracystis akinetos, Chlamydomonas asymmetrica и Chlamydomonas mexicana были равны 2,4–2,6%, 1,7–2,0 и 1,7–2,5%, соответственно. При анализе первичной структуры ITS2 мы получили сходную топологию дерева, однако кластеризация рода Fasciculochloris c Chlamydomonas asymmetrica и Chlamydomonas mexicana подтверждена не была (рис. 3). Вместе с тем более вариабельный молекулярный маркер ITS2 со 100%-ной статистической поддержкой подтвердил разделение изученных штаммов по местообитанию: группа штаммов ACSSI 006, 008, 019, 021 и 055 из серой лесной почвы Московской области и ACSSI 172, 173 и 174 из солонцов Волгоградской области кластеризовались отдельно. Внутривидовые различия ITS2 для Fasciculochloris boldii не превышали 3,4%, в то время как различия по сравнению с Chlamydomonas asymmetrica варьировали от 26,7 до 30,2%, а с Chlamydomonas mexicana – от 14,7 до 19,8%.
Рис. 3. Укорененное филогенетическое дерево зеленых водорослей рода Fascuculochloris и близкородственных таксонов, построенное методом максимального правдоподобия (ML), на основе анализа первичной структуры ITS2 (284 п.н.). Fig. 3. The rooted phylogenetic tree of green microalgal genus Fasciculochloris and closely related taxa constructed by maximal likelihood method (ML) for ITS2 sequence data (284 bp).
Вторичная структура ITS2 изученных штаммов F. boldii характеризовалась типичными признаками для зеленых водорослей (Chlorophyta): четыре неразветвленные шпильки (стебель-петля), пиримидин-пиримидиновое несовпадение (mismatch) – неспаренный участок U-U во II шпильке, длинная III шпилька с консервативным мотивом GGUAGG на верхушке (Mai, Coleman, 1997; Schultz et al., 2005; Coleman, 2007). Сравнение вторичной структуры ITS2 изученных штаммов F. boldii из солонцов и серой лесной почвы показало наличие одной компенсаторной замены в IV шпильке (рис. 4). Вторичная структура ITS2 штаммов F. boldii из солонцов отличалась от таковой у C. rapa f. vasta присутствием дополнительной компенсаторной замены на верхушке II шпильки (рис. 4). При сравнении ITS2 штаммов из серой лесной почвы и C. rapa f. vasta обнаружена одна компенсаторная замена на верхушке II шпильки (данные не показаны). Перечисленные замены не учитываются при разделении видов (Coleman, 2000, 2009).
Рис. 4. Вторичная структура ITS2 штамма F. boldii ACSSI 174, изолированного из солонца. Fig. 4. ITS2 secondary structure of strain F. boldii ACSSI 174, isolated from solonetz.
ITS2 у зеленых водорослей (Chlorophyta) имеет длину 128–483 основания (Buchheim et al., 2011). В нашем исследовании длина ITS2 штаммов F. boldii варьировала от 238 до 240 нуклеотидов. Все штаммы, в том числе и Chlamydomonas rapa f. vasta CCAP 11/73, имели идентичный консервативный мотив в III шпильке (табл. 2), отличный от мотива C. mexicana, C. asymmetrica, C. reinhardtii, C. baca, N. sempervirens. Таким образом, на основании топологии 18S- и ITS2-деревьев, сравнения вторичной структуры ITS2, отсутствия компенсаторных замен в консервативных регионах можно предположить объединение всех штаммов, вошедших в кладу Fasciculochloris вместе c аутентичным штаммом SAG 27.95, под общим названием F. boldii, в том числе и C. rapa f. vasta CCAP 11/73, C. rapa NIES-2234, C. inflexa NIES-2216.
Таблица 2. Свойства ITS2 штаммов Fasciculochloris и близкородственных таксонов
Заключение 18S рРНК- и ITS2-филогения подтвердила с максимальной статистической поддержкой образование клады Fasciculochloris, в которую вошли аутентичные штаммы F. boldii SAG 27.95 и C. rapa f. vasta CCAP 11/73, а также изученные дикие штаммы ACSSI 006, 008, 019, 021, 055, 172, 173, 174. Коллекционные штаммы ACSSI обладали морфологическими признаками, типичными для рода Fasciculochloris: способностью к десмосхизису, наличием пристенного хлоропласта с одним пиреноидом и зооспор с двумя слегка неравными по длине жгутиками. От типового диагноза дикие штаммы отличались полым шаровидным хлоропластом, а не чашевидным, и отсутствием многоклеточных пакетов. Генетические различия внутри клады на 18S рРНК-дереве составляли от 0,1 до 0,3%, на ITS2-дереве — от 0 до 3,4%. Все представители рода имели длину ITS2, равную 238–240 нуклеотидам, и одинаковый консервативный мотив AGCUGGGUAGGU III шпильки ITS2, отличный от других близкородственных таксонов. Компенсаторные замены в консервативных регионах ITS2 отсутствовали, что позволяет отнести все перечисленные штаммы к одному виду – F. boldii. Таким образом, впервые в серых лесных почвах и солонцах России были обнаружены находки зеленой водоросли F. boldii, подтвержденные с помощью морфологического и молекулярно-генетического анализов. Всего в коллекцию ACSSI было депонировано 8 штаммов, выделенных из Московской и Волгоградской областей. Вероятно, данный вид часто встречается в различных почвах, но ошибочно принимается за другие виды при просмотре смешанных культур. Как показало наше исследование, даже получение штамма не гарантирует точность идентификации представителей рода Fasciculochloris, которые чаще описываются как виды C. rapa, C. rapa f. vasta, C. inflexa. Длительное наблюдение штаммов с использованием световой микроскопии и анализ двух филогенетических маркеров, в том числе и вторичной структуры ITS2, позволили надежно идентифицировать изученные штаммы и определить видовые границы. Благодарности Авторы выражают признательность д.б.н., проф. И.Ю. Костикову за консультации по использованию вторичной структуры ITS2 и к.б.н., с.н.с. М.В. Ельцову за участие в экспедиционных работах в Волгоградской области. Работа выполнена при поддержке PФФИ в рамках научного проекта №16-34-60020 мол_а_дк.
Список литературы
Статья поступила в редакцию 7.08.2018
Fasciculochloris boldii (Chlorophyceae, Chlorophyta) from soils of Russia Anna D. Temraleeva, Svetlana V. Moskalenko, Elena A. Portnaya Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science RAS (Pushchino, Russia) According to the 18S rRNA and ITS2 assays, the strains ACSSI 006, 008, 019, 021, 055 from the gray forest soil (Moscow region) and ACSSI 172, 173, 174 from solonetzic soils (Volgograd region) were identified as Fasciculochloris boldii. All strains were characterized by the morphological features typical for Fasciculochloris: ability to desmoschisis, the presence of a parietal chloroplast with one pyrenoid and zoospores with two flagellates slightly unequal in length. From a typical diagnosis, the ACSSI strains were distinguished by a hollow spherical, rather than a cup-shaped chloroplast, and the absence of multicellular packages. The genetic differences within the Fasciculochloris-clade on the 18S rRNA tree range from 0,1 to 0,3%, on the ITS2-tree from 0 to 3,4%. All members of the genus had an ITS2 length equal to 238–240 nucleotides and the identical conservative motive AGCUGGGUAGGU III helix of the ITS2, different from other closely related taxa. Compensatory base changes of ITS2 conservative regions were absent, which allowed all of the strains to be listed to one species – F. boldii. Thus, for the first time findings of green alga F. boldii, confirmed by morphological and molecular genetic analysis, from gray forest and solonetzic soils of Russia were confirmed. Key words: green algae; morphology; 18S rRNA; ITS2; soils; ACSSI.
Об авторах Темралеева Анна Дисенгалиевна - Temraleeva Anna D. кандидат биологических наук
Москаленко Светлана Валентиновна - Moskalenko Svetlana V. научный сотрудник Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, Россия, (Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science RAS, Russia, Pushchino)
Портная Елена Анатольевна - Portnaya Elena A. инженер Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, Россия (Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science RAS, Russia, Pushchino) balandossa@mail.ru Корреспондентский адрес: Россия, 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2, ИФХиБПП РАН; телефон: 8(4967)31-81-70.
ССЫЛКА НА СТАТЬЮ: Темралеева А.Д., Москаленко С.В., Портная Е.А. Fasciculochloris boldii (Chlorophyceae, Chlorophyta) в почвах России // Вопросы современной альгологии. 2018. №2 (17). URL: http://algology.ru/1347
При перепечатке ссылка на сайт обязательна
На ГЛАВНУЮ
|
|
|
 | | ||
|
| ||
