Давидович Н.А.

Nickolai A. Davidovich

Карадагская научная станция имени Т.И. Вяземского – природный заповедник РАН
(Феодосия, Россия)
 

УДК 582.26+57.083.1

При введении в культуру и содержании диатомовых водорослей приходится решать проблему их контаминации посторонними организмами, от вирусов, микоплазм и бактерий, до простейших и многоклеточных. В зависимости от решаемых задач целесообразно использовать культуры разной степени чистоты, от моновидовой (альгологически чистой) до аксеничной. Контаминация культур может быть изначальной (первичной) и случайной в процессе содержания (вторичной). Обсуждаются примеры контаминации, в частности кинетопластидой Bodo saltans.

Ключевые слова: диатомовые; культуры; микроорганизмы; простейшие; контаминация.

Одна из серьезных и широко распространенных проблем, с которой приходится сталкиваться в процессе культивирования диатомовых водорослей ― контаминация культур различными микроорганизмами. Перечень микроорганизмов обширен, он включает вирусы, микоплазмы, бактерий (среди них внутриклеточные паразиты), грибы, простейших. Иногда весьма затруднительно установить их видовую принадлежность, прежде всего ввиду малых размеров и слабой изученности. Проблема контаминации более многоплановая, чем может показаться на первый взгляд. Известны, например, такие явления как эндосимбиоз бактерий (Schmid, 2003), или зависимость роста диатомовых от витамина B₁₂, вырабатываемого бактериями (Croft et al., 2005). Эти примеры затрудняют интерпретацию самого понятия контаминации. Загрязнение культур может рассматриваться и с точки зрения «генетического загрязнения» вследствие так называемого горизонтального переноса генетической информации, осуществляемого вирусами, бактериями, что может повлиять на генетическую чистоту культивируемых клеточных линий.

Работа с чистыми культурами широко известна в альгологической практике. Для их получения применяют обширный арсенал методов, которые позволяют ввести в культуру одноклеточные микроорганизмы, в том числе водоросли (Кабанова, 1961; Andersen, Kawachi, 2005; Гайсина и др., 2008; Орлова и др., 2011). Используют как традиционные, давно известные подходы (микропипеточный метод, посев на агар, последовательное разбавление), так и недавно вошедшие в практику (сепарация в проточном цитометре).

Выделяя ту или иную водоросль в культуру, в первую очередь ведут речь о ее альгологической чистоте, которая подразумевает отсутствие в культуре иных видов водорослей. Корректным следует считать введение в культуру отдельных клонов, представляющих интересующий нас вид. Содержание видовой культуры, в которой находится неизвестное количество генетических линий, в наше время малоактуально. Следует признать, однако, что даже это простое на первый взгляд требование не всегда легко выполнимо на практике. Нередко в пробах попадаются водоросли, темп деления которых выше интересующего нас вида, размер клеток меньше, а численность намного больше. На этапе выделения, а также в случае заражения культур избавиться от таких мелких, быстро размножающихся контаминантов иногда весьма сложно.

Даже исключив попадание в культуру посторонних видов можно случайно, не подозревая об этом, захватить несколько клеток выделяемого вида. В случае с диатомовыми водорослями для подтверждения не только моновидового, но и клонового характера полученной культуры, можно опираться на тот факт, что у подавляющего числа видов клетки клона уменьшаются в ходе митотических делений (Mann, 2011). В природе клетки клона редко располагаются локально, нормальным следует считать случайный перенос, обеспечивающий их широкое распространение. Поэтому, когда во вновь созданной культуре, основой для которой послужила локальная («точечная») проба, наблюдаются разноразмерные клетки, это может служить высокодостоверным признаком присутствия в культуре нескольких клоновых линий.

Следующий этап, или следующий уровень очистки – создание так называемой аксеничной культуры, т.е. такой, в которой нет иных живых объектов кроме необходимого нам вида водоросли. Соблюдение всех необходимых процедур на этом этапе требует высокой микробиологической культуры выполнения работ, навыков и значительного опыта, и даже в этом случае практика показывает, что появление контаминантов в культурах – не редкость.

Целесообразно, таким образом, выделение нескольких классов чистоты культур. Самый высокий класс чистоты можно установить для культур, свободных от каких бы то ни было посторонних организмов. Создание и поддержание таких культур требует особых условий и не всегда оправдано с позиций решаемых задач. На втором уровне можно расположить моновидовые культуры водорослей, в которых нет иных эукариотических организмов, но могут присутствовать археи и бактерии. Наличие цианобактерий исключается. На третьем уровне будут так называемые альгологически чистые культуры, т.е. представленные одним видом водоросли, но при этом в них могут присутствовать какие угодно другие одноклеточные и даже, порой, многоклеточные организмы.

Контаминация культур может быть изначальной, присутствие контаминанта может при этом допускаться или не фиксироваться, например, при внутриклеточном паразитизме, когда о заражении культур до определенного времени даже не подозревают. В ряде случаев при недоскональном или кажущемся соблюдении всех необходимых мер в культуры попадают посторонние организмы уже в процессе культивирования (вторичное заражение). В любом случае следует пытаться избавиться от контаминантов, применяя разные способы очистки. Мы в своей практике неоднократно сталкивались со случаями загрязнения культур диатомовых. Один из последних связан с кинетопластидой Bodo saltans Ehrenberg, 1832, численность которого заметно возросла в культурах, редко пересеваемых в свежую среду. По-видимому, культуры были заражены кинетопластидой изначально. В стационарной фазе роста культур темп деления диатомовых снижался, часть из них погибала, становясь субстратом для развития бактерий и, вслед за этим, представителей следующего трофического звена ― кинетопластид. Круг, таким образом, замыкался, культуры погибали. Из-за того, что соотношение численности кинетопастид и диатомовых оказывалось далеко не в пользу последних, пересевы в свежую среду не вели к восстановлению культур. Мы прибегли к обработке культур амфотерицином В ― полиеновым макроциклическим антибиотиком, активным в отношении некоторых простейших и грибов. Амфотерицин В не убивал кинетпластид, однако приводил к изменению их поведения, и, судя по визуальным наблюдениям, в определенной степени ингибировал их размножение. Процедура обработки амфотерицином В и последующая отмывка приводила к желаемому результату очистки культур от контаминанта. Заметим, что в первые дни после обработки амфотерицином В темп деления водорослей несколько снижался, однако в последующем восстанавливался до прежнего уровня, и далее культуры приходилось пересевать с обычной периодичностью.

Наверное, будет не лишним еще раз подчеркнуть, что одним из главных факторов, определяющих степень чистоты культур, помимо соблюдения всех предосторожностей, принятых в микробиологии, является «содержание водорослей в благоприятных для них условиях, заключающихся в регулярном и своевременном их пересеве» (Кабанова, 1961: 210). Для диатомовых этот тезис особенно актуален, поскольку при обычно принятых условиях содержания их культуры очень быстро, за 10–20 дней, достигают стационарной фазы роста, после чего наступает фаза деградации (Орлова и др., 2011).

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Список литературы

1. Гайсина Л.А., Фазлутдинова А.И, Кабиров Р.Р. Современные методы выделения и культивирования водорослей: учебное пособие. – Уфа: Изд-во БГПУ, 2008. – 152 с.
2. Кабанова Ю.Г. О культивировании в лабораторных условиях морских планктонных диатомовых и перидиниевых водорослей // Труды Института океанологии. 1961. Т. 47. С. 203–216.
3. Орлова Т.Ю., Айздайчер Н.А., Стоник И.В. Лабораторное культивирование морских микроводорослей, включая продуцентов фитотоксинов: научно-методическое пособие. – Владивосток: Дальнаука, 2011. – 89 с.
4. Andersen R.A., Kawachi M. Traditional microalgae isolation techniques // Andersen R.A. (ed.). Algal culturing techniques. – New York: Elsevier Academic Press, 2005. – P.83–100.
5. Croft M.T., Lawrence A.D., Raux-Deery E., Warren M.J., Smith A.G. Algae acquire vitamin B₁₂ through a symbiotic relationship with bacteria // Nature. 2005. V.438 (7064). P.90–93. DOI: https://doi.org/10.1038/nature04056.
6. Mann D.G. Size and Sex // Seckbach J., Kociolek J.P. (eds.). The Diatom World. Cellular origin, life in extreme habitats and astrobiology. V.19. – Dordrecht: Springer, 2011. – P.145–166. DOI: https://doi.org/10.1007/978-94-007-1327_6.
7. Schmid A.-M.M. Endobacteria in the diatom Pinnularia (Bacillariophyceae). I. «Scattered ct-nucleoids» explained: dapi–dna complexes stem from exoplastidial bacteria boring into the chloroplasts // Journal of Phycology. 2003. V.39, Is.1. P. 122–138. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1529-8817.2003.02084.x.

Статья поступила в редакцию 1.06.2019
Статья принята к публикации 21.07.2019

Об авторе

Давидович Николай Александрович – Nickolai A. Davidovich

кандидат биологических наук
ведущий научный сотрудник, зав. лабораторией водорослей и микробиоты, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Карадагская научная станция им. Т.И. Вяземского – природный заповедник РАН», Феодосия, Россия (Federal State Budget Scientific Institution «Karadag Scientific Station by T.I. Vyazemsky – Nature Reserve of RAS», Feodosiya, Russia)

nickolaid@yandex.ru

Корреспондентский адрес: Россия, 298188, г. Феодосия, пгт. Курортное, ул. Науки, 22. Телефон: (978)852-09-02.

ССЫЛКА:

Давидович Н.А. Контаминация культур диатомовых водорослей посторонними микроорганизмами // Вопросы современной альгологии. 2019. № 2 (20). С. 291–294. URL: http://algology.ru/1546

DOI – https://doi.org/10.33624/2311-0147-2019-2(20)-291-294

При перепечатке ссылка на сайт обязательна

Contamination of diatom cultures with other microorganisms

Nickolai A. Davidovich

Karadag Scientific Station by T.I. Vyazemsky – Nature Reserve of RAS (Feodosiya, Russia)

During establishing and maintenance of diatom cultures one have to solve the problem of their contamination by other organisms, from viruses, mycoplasma and bacteria, to protozoa and metazoa. Depending on the task to be solved, it is advisable to use cultures of different degrees of purity, from mono-species (algologically pure) to axenic. Contamination of cultures can be initial (primary) and random in the process of cutivation (secondary). Examples of contamination are discussed, in particular with the kinetoplastid Bodo saltans.

Key words: diatoms; cultures; microorganisms; protozoa; contamination.

References

1. Andersen R.A., Kawachi M. Traditional microalgae isolation techniques. In: Andersen R.A. (ed.). Algal culturing techniques. Elsevier Academic Press, New York, 2005. P.83–100.
2. Croft M.T., Lawrence A.D., Raux-Deery E., Warren M.J., Smith A.G. Algae acquire vitamin B₁₂ through a symbiotic relationship with bacteria. Nature. 2005. V.438 (7064). P. 90–93. DOI: https://doi.org/10.1038/nature04056.
3. Gajsina L.A., Fazlutdinova A.I, Kabirov R.R. Sovremennye metody vydeleniya i kul'tivirovaniya vodoroslej: uchebnoe posobie [Modern methods of isolation and cultivation of algae: a textbook]. Izdatelstvo BGPU, Ufa, 2008. 152 p. (In Russ.)
4. Kabanova Yu.G. O kul'tivirovanii v laboratornyh usloviyah morskih planktonnyh diatomovyh i peridinievyh vodorolsej [On the cultivation of marine planktonic diatoms and peridinium algae in the laboratory]. Trudy Instituta okeanologii. 1961. V.47. P. 203–216. (In Russ.)
5. Mann D.G. Size and Sex. In: Seckbach J., Kociolek J.P. (eds.). The Diatom World. Cellular origin, life in extreme habitats and astrobiology. V.19. Springer, Dordrecht, 2011. P.145–166. DOI: https://doi.org/10.1007/978-94-007-1327_6.
6. Orlova T.Yu., Ajzdajcher N.A., Stonik I.V. Laboratornoe kul'tivirovanie morskih mikrovodoroslej, vklyuchaya produtsentov fitotoksinov: nauchno-metodicheskoe posobie [Laboratory cultivation of marine microalgae, including producers of phytotoxins: a scientific and methodological guide]. Dal'nauka, Vladivostok, 2011. 89 p. (In Russ.)
7. Schmid A.-M.M. Endobacteria in the diatom Pinnularia (Bacillariophyceae). I. “Scattered ct-nucleoids” explained: dapi–dna complexes stem from exoplastidial bacteria boring into the chloroplasts. Journal of Phycology. 2003. V.39, Is.1. P.122–138. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1529-8817.2003.02084.x.

Author

Davidovich N.A. 

ORCID - https://orcid.org/0000-0002-3510-0453, Scopus Author ID - 6603538737,
ResearcherID - G-2304-2017, eLIBRARY Author ID - 753282.

Karadag Scientific Station by T.I. Vyazemsky – Nature Reserve of RAS, Feodosiya, Russia

karadag-algae@yandex.ru

ARTICLE LINK:

Davidovich N.A. Contamination of diatom cultures with other microorganisms. Voprosy sovremennoi algologii (Issues of modern algology). 2019. № 2 (20). С. 291–294. URL: http://algology.ru/1546

DOI – https://doi.org/10.33624/2311-0147-2019-2(20)-291-294

When reprinting a link to the site is required

На ГЛАВНУЮ

Карта сайта

КОНТАКТЫ

Email: info@algology.ru

Изготовление интернет сайта
5Dmedia

ЛИЦЕНЗИЯ

Эл N ФС 77-22222 от 01 ноября 2005г.

ISSN 2311-0147