Давыдов Д.А.^1,2, Шалыгин С.С.³, Вильнет А.А.¹, Редькина В.В.² 

Denis A. Davydov, Sergei S. Shalygin, Anna A. Vilnet, Vera V. Redkina

¹Полярно-альпийский ботанический сад-институт имени Н.А. Аврорина
(Кировск, Россия)
²Институт проблем промышленной экологии Севера –
обособленное подразделение ФИЦ «Кольский научный центр РАН» (Апатиты, Россия)
³Университет Нью-Мексико (Лас Круцес, США)

УДК 582.232

Штамм KPABG LID-610023, морфологически соответствующий Chroococcus s.str., был выделен из почвы под антропогенным лугом на побережье Баренцева моря (Мурманская область, Россия). Культура изучалась с помощью светового микроскопа, получены нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК и внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS). Филогенетический анализ выявил родство штамма KPABG LID-610023 со штаммами рода Inacoccus, при наличии морфологических и генетических отличий от единственного известного вида – Inacoccus carmineus. Изученный штамм не имеет цветных гиалиновых оболочек и не формирует наноциты. Последовательности гена 16S рРНК и ITS штамма KPABG LID-610023 явственно отличают его от Inacoccus carmineus. Выявлены различия в нуклеотидном составе, длине и вторичной структуре петель D1–D1' и Box-B у штамма KPABG LID-610023 и Inacoccus carmineus. Эти результаты свидетельствуют о том, что штамм KPABG LID-610023 потенциально является новым представителем рода Inacoccus. Морфологическая дифференциация таксона затруднена, возможно, он является криптическим видом, так как по своим признакам он явственно не отличим от Chroococcus pallidus Näg.

Ключевые слова: Chroococcus; Inacoccus; криптический вид

Широкое использование анализа генетической информации приводит к значительным изменениям в систематике цианобактерий. Использование молекулярных данных позволяет выявлять филогенетические связи цианобактерий. Значительно пересмотрен состав многих родов, которые в парадигме морфологической систематики принято было считать монофилетичными. Результаты исследований рода Chroococcus s.l. демонстрируют его полифилетичность и наличие криптических видов (Komárková et al., 2010; Kováčik et al., 2011; Gama et al., 2019).

Трудности при изучении филогении коккоидных форм цианопрокариот связаны с отсутствием необходимых культур. В частности, по морфологическим признакам в роде Chroococcus s.l. описано пятьдесят шесть видов и только для четырех из них были получены последовательности генов 16S рРНК (Komárková et al., 2010; Kováčik et al., 2011).

К роду Chroococcus Näg. (1849) традиционно относятся виды, которые характеризуются более-менее сферическими слизистыми колониями, в которых клетки имеют собственные слизистые чехлы. Клетки никогда не бывают соединены в ряды. Генетический материал типового образца вида рода Chroococcus rufescens (Kütz.) Näg. (Nägeli, 1849, с. 46) не изучался. Данный вид был описан F.T. Kützing из региона Нормандия в северо-западной Франции в коммуне Arromanches-les-Bains. Голотип был помещен в гербарий Sebastian René Lenormand. Предположительно в настоящий момент хранится в гербарии университета города Кан.

На основании полифазного подхода род Chroococcus s.l. был разделен на два (Komárková et al., 2010, Kováčik et al., 2011). Штаммы видов Chroococcus virescens CCALA 701 (GQ375046), Chroococcus cf. westii CCALA 702 (GQ375044), C. prescotti JJCV (AM710385), C. minutus 055 Hindak (GQ375047), C. minutus 057 Hindak (GQ375045) отнесены к Chroococcus s.str., а вид C. limneticus отнесен к вновь описанному роду – Limnococcus (Komárek & Anagnostidis) Komárková et al. (2010).

Род Limnococcus морфологически слабо отличается от Chroococcus  s.str. Основные отличия сводятся к тому, что клетки дорастают до первоначальной сферической формы перед следующим делением и отсутствуют слои в расплывающихся бесцветных слизистых оболочках. Род преимущественно включает планктонные пресноводные и морские виды.

В работе Gama et al. (2019) были обнаружены штаммы, морфологически не отличимые от Chroococcus s.str., которые, однако, обособленны от данной клады по молекулярным данным. Эти штаммы отнесены авторами к новому роду Cryptococcum, включающему два вида C. brasiliense Gama et al. и C. komarkovaum Gama et al. Виды рода Cryptococcum имеют полусферические до закругленных клетки 8,3–15,5 мкм диаметром, которые располагаются одиночно или собраны в малоклеточные колонии. Слизистые чехлы гомогенные или слоистые. Таким образом, дифференциация представителей родов Chroococcus s.str. и Cryptococcum при морфологическом определении достоверно невозможна. Cryptococcum komarkovaum может быть ошибочно принят за другие виды рода Chroococcus s.str. термальных источников – C. membraninus (Menegh.) Näg. и C. globosus (Elenk.) Hindak. Cryptococcum brasiliense по размерам клеток, морфологии и экологии сходен с Chroococcus pallidus (Näg.) Näg., C. helveticus Näg.

Наряду с родом Cryptococcum был описан другой новый род Inacoccus (Gama et al., 2019), его морфологические отличия от Chroococcus s.str. заключаются в интенсивной красно-коричневой окраске слизистых оболочек некоторых клеток и формировании наноцитов.

Нами при изучении штамма, выделенного из почвы на побережье Баренцева моря в районе поселка Росляково (Мурманская область), был обнаружен потенциально новый вид рода Inacoccus.

Штамм был выделен из верхнего слоя почвы в антропогенном местообитании под злаковой дерниной Deschampsia cespitosa (L.) P. Beauv. в сообществе с участием Salix caprea  L., Taraxacum officinale F.H. Wigg., Trifolium pretense  L. Почва характеризовалась влажностью в 12% и рН 6,2. После отбора образцы почвы были помещены в стерильный пакет. В лаборатории образец был посеян на агаризованную среду Z8 (Kotai, 1972, Waterbury, 2006). После выделения штамм был очищен путем нескольких пересевов на жидкие и твердые среды. Культивирование осуществлялось на световых установках, оснащенных лампами с интенсивностью 35 мкмоль фотонов на 1 кв.м, при соотношении периодов свет/темнота 16/8 ч. Штамм помещен в коллекцию культур Полярно-альпийского ботанического сада-института (KPABG) под номером LID-610023. Информация о местонахождении включена в информационную систему CRIS (Мелехин и др., 2013, Melekhin et al., 2019).

Морфология штамма изучена с помощью микроскопа AxioScope A1 (Carl Zeiss, Germany). Для выявления размеров проведено измерение 85 клеток на разных стадиях культивирования.

ДНК была выделена из моновидовой альгологической культуры с помощью набора NucleoSpin Plant Kit (Macherey-Nagel, Germany) в соответствии с протоколом производителя. Амплификацию последовательностей осуществляли с помощью праймеров 1 (5’-CTC TGT GTG CCT AGG TAT CC-3’) (Wilmotte et al., 1993) и 2 (5’-GGG GGA TTT TCC GCA ATG GG-3’) (Nübel et al., 1997) в амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия). ПЦР проводили в объёме 20 мкл в следующем алгоритме: 3 мин при 94°C, 30 циклов (30 с 94°C, 40 с 56°C, 60 с 72°C) и 2 мин элонгации при 72°C. Амплифицированные фрагменты оценивали по результатам электрофореза в 1х TAE-буфере в 1% агарозном геле с использованием бромистого этидия. Матрицы очищали набором GFX PCR DNA Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences, USA). Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA). Для штамма получен один амплификат и собрана одна последовательность локуса, содержащего ген 16SрРНК и межгенный спейсер 16S-23SITS рРНК.

В выравнивание нуклеотидных последовательностей 16S включены штаммы, относящиеся к родам Chroococcus s.str., Cryptococcum, Inacoccus и близкородственные таксоны, всего 146 образцов. Выравнивание выполнено в программе BioEdit (Hall, 1999). Предварительный филогенетический анализ выполнен методом максимального правдоподобия в программе PhyML v. 3.0 (Guindon et al., 2010) с использованием модели нуклеотидных замен GTR+I+G и 500 реплик бутстрепа.

Изученный штамм LID-610023 на агаризованной среде формирует микроскопические, аморфные колонии, состоящие преимущественно из четырех клеток. Клетки до деления округлые, при первом делении делятся пополам на две равные части, в дальнейшем, не дорастая до размеров первоначальной клетки, делятся еще раз с формированием 4-клеточных колоний в виде секторов круга (четвертей). Клетки сине-зеленые или оливково-зеленые. Диаметр клеток (8,1)9–10,6(12) мкм, в среднем 9,86 (±0,82) мкм. Клетки в жидкой культуре более зеленые, на агаре – синезеленые. Клеточная оболочка в жидкой культуре и в молодых стадиях роста на агаре почти незаметная, в старых культурах – более выражена, всегда бесцветная, не слоистая. В молодых культурах встречаются только 1–2-клеточные колонии, в старых 2–4-клеточные. Образований типа беоцитов/наноцитов не обнаружено.

Морфологически штамм LID-610023 соответствует оригинальному описанию Chroococcus pallidus Näg. Последний был найден на влажных скальных стенках в Швейцарии. Вид характеризуется малоклеточными колониями (до 8 клеток), бесцветными бесструктурными слизистыми оболочками и размерами клеток (5)6–11(13) мкм.

На филогенетическом древе изученный штамм LID-610023 занимает сестринское положение относительно штаммов Inacoccus carmineus CCIBt 3411, 3418 и 3475. При этом он отличается от типового вида – сходство нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК (p-distance) с разными штаммами Inacoccus carmineus составляет 97,58–97,76%. Сравнение штамма LID-610023 со штаммами родов Cryptococcum, Chroococcus s.str., Limnococcus демонстрирует бóльшие отличия (от 88 до 93%). Общее расположение клад находится в соответствии с филогенией Chroococcus s.l., полученной в работе Gama с соавт. (2019).

Таким образом, штамм KPABG LID-610023 следует трактовать как новый вид рода Inacoccus, характеризующийся высоким морфологическим сходством с Chroococcus pallidus Näg. Современная таксономия и систематика Chroococcus s.l. требует тщательного изучения на основе комплексного подхода.

Работа выполнена в рамках Госзадания № гос. регистрации АААА-А18-118050490088-0 и при поддержке гранта РНФ № 21-14-00029.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данном сообщении.

Список литературы

1. Мелехин А.В., Давыдов Д.А., Шалыгин С.С., Боровичев Е.А. Общедоступная информационная система по биоразнообразию цианопрокариот и лишайников CRIS (Cryptogamic Russian Information System) // Бюл. Моск. о-ва испытателей природы. Отд. биол. 2013. Т. 118. Вып. 6. С. 51–56.
2. Gama W.A., Rigonato J., Fiore M.F., Sant'Anna C.L. New insights into Chroococcus (Cyanobacteria) and two related genera: Cryptococcum gen. nov. and Inacoccus gen. nov. // European Journal of Phycology. 2019. V.54, №3. P. 315–325. DOI – https://doi.org/10.1080/09670262.2018.1563913
3. Guindon S., Dufayard J.F., Lefort V., Anisimova M., Hordijk W., Gascuel O. New Algorithms and Methods to Estimate Maximum-Likelihood Phylogenies: Assessing the Performance of PhyML 3.0 // Systematic Biology. 2010. V. 59. P. 307–321. DOI – https://doi.org/10.1093/sysbio/syq010
4. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symposium Series. 1999. V. 41. P. 95–98.
5. Komárková J., Jezberová J., Komárek O., Zapomělová E. Variability of Chroococcus (Cyanobacteria) morphospecies with regard to phylogenetic relationships // Hydrobiologia. 2010. V. 639. P. 69–83. DOI – https://doi.org/ 10.1007/s10750-009-0015-3
6. Kotai J. Instructions for preparation of modified nutrient solution Z8 for algae. Norwegian Institute for Water Research, Blindern, Oslo. 1972. V. 11/69. 5 p.
7. Kováčik L., Jezberová J., Komárková J., Kopecký J., Komárek J. Ecological characteristics and polyphasic taxonomic classification of stable pigment-types of the genus Chroococcus (Cyanobacteria) // Preslia. 2011. V. 83. P. 145–166.
8. Melekhin A.V., Davydov D.A., Borovichev E.A., Shalygin S.S., Konstantinova N.A. CRIS – service for input, storage and analysis of the biodiversity data of the cryptogams // Folia Cryptogamica Estonica. 2019. V. 56. P. 99–108. DOI – https://doi.org/10.12697/fce.2019.56.10
9. Nägeli C. Gattungen einzelliger Algen, physiologisch und systematisch bearbeitet. Neue Denkschriften der Allg. Schweizerischen Gesellschaft für die Gesammten Naturwissenschaften. 1849. V. 10. P. 1–139.
10. Nübel U., Garcia-Pichel F., Muyzer G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3327–3332. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.63.8.3327-3332.1997
    
11. Waterbury J.B. The Cyanobacteria – isolation, purification and identification // Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E.H. (eds.) The Prokaryotes. – New York: Third. Springer, 2006. – P. 1053–1073. DOI – https://doi.org/10.1007/0-387-30744-3_38
12. Wilmotte A., Van Der Auwera C., De Wachter R. Structure of the 16S ribosomal RNA of the thermophilic cyanobacteria Chlorogloeopsis HTF (‘Mastigocladus laminosus HTF’) strain PCC7518, and phylogenetic analysis // FEBS Lett. 1993. V. 317. P. 96–100. DOI – https://doi.org/10.1016/0014-5793(93)81499-p

Статья поступила в редакцию 20.06.2021
Статья поступила после доработки 19.10.2021
Статья принята к публикации 25.10.2021

Об авторах

Давыдов Денис Александрович – Denis A. Davydov

кандидат биологических наук,
Полярно-альпийский ботанический сад-институт им. Н.А. Аврорина, Кировск, Россия (Polar Alpine Botanical Garden Institute KSC RAS, Kirovsk, Russia), лаборатория флоры и растительности; Институт проблем промышленной экологии Севера – обособленное подразделение ФИЦ «Кольский научный центр РАН», Апатиты, Россия (Institute of the North Industrial Environmental Problems – Subdivision of FRC «Kola Science Center RAS», Apatity, Russia)

d_disa@mail.ru

Шалыгин Сергей Сергеевич – Sergei S. Shalygin

кандидат биологических наук,
Университет Нью-Мексико, Лас Круцес, США (New Mexico State University, Las Cruces, USA), Department of Plant and Environmental Sciences

got.lifemusic@gmail.com

Вильнет Анна Александровна – Anna A. Vilnet

кандидат биологических наук,
Полярно-альпийский ботанический сад-институт им. Н.А. Аврорина, Кировск, Россия (Polar Alpine Botanical Garden Institute KSC RAS, Kirovsk, Russia), лаборатория флоры и растительности

anya_v@list.ru

Редькина Вера Вячеславовна – Vera V. Redkina

кандидат биологических наук
Институт проблем промышленной экологии Севера – обособленное подразделение ФИЦ «Кольский научный центр РАН», Апатиты, Россия (Institute of the North Industrial Environmental Problems – Subdivision of FRC «Kola Science Center RAS», Apatity, Russia)

kalmykova_v_v@mail.ru

Корреспондентский адрес: Россия, 184209, Мурманская область, г. Апатиты, Академгородок, 14А, ИППЭС КолНЦ РАН; тел. (815)9-64-94.

ССЫЛКА:

Давыдов Д.А., Шалыгин С.С., Вильнет А.А., Редькина В.В. Характеристика штамма KPABG LID-610023 группы Chroococcus s.l. (Cyanoprokaryota) // Вопросы современной альгологии. 2021. № 2 (26). P. 108–113. URL: http://algology.ru/1696

DOI – https://doi.org/10.33624/2311-0147-2021-2(26)-108-113

При перепечатке ссылка на сайт обязательна

Уважаемые коллеги! Если Вы хотите получить версию статьи в формате PDF, пожалуйста, напишите в редакцию, и мы ее вам с удовольствием пришлем бесплатно. 
Адрес - info@algology.ru

The morphological characteristic strain KPABG LID-610023 of Chroococcus s.l. group (Cyanoprokaryota)

Denis A. Davydov^1,2, Sergei S. Shalygin³, Anna A. Vilnet¹, Vera V. Redkina²

¹Polar Alpine Botanical Garden Institute KSC RAS (Kirovsk, Russia)
²Institute of the North Industrial Environmental Problems KSC RAS (Apatity, Russia)
³New Mexico State University (Las Cruces, USA)

The Chroococcus-like strain was collected from anthropogenic meadow on the Barents Sea coast (Murmansk Region, Russia). It was studied by light microscope, the nucleotide sequences of 16S rRNA and ITS were obtained. Based on 16S rRNA phylogenetic analysis, the strain KPABG LID-610023 was placed in the clade of Inacoccus in spite of morphological and molecular differences from one already established species: Inacoccus carmineus. Morphologically the tested strain did not show colored hyaline envelopes, and nanocytes were absent. The nucleotide sequences of 16S rRNA gene clearly demonstrated a genetic difference, separating it from Inacoccus carmineus. In addition, we compared ITS sequences of KPABG LID-610023 strain and Inacoccus carmineus and found that nucleotide composition, length, and secondary structures of D1–D1' and Box-B were different. These results suggest that the strain KPABG LID-610023 appear to be a new species of the genus Inacoccus. Possibly this new species is a cryptic taxon due to its morphological similarity with Chroococcus pallidus Näg.

Key words:  Chroococcus, Inacoccus, cryptic species.

References

1. Gama W.A., Rigonato J., Fiore M.F., Sant'Anna C.L. New insights into Chroococcus (Cyanobacteria) and two related genera: Cryptococcum gen. nov. and Inacoccus gen. nov. European Journal of Phycology. 2019. V. 54, N3. P. 315–325. DOI: https://doi.org/10.1080/09670262.2018.1563913
2. Guindon S., Dufayard J.F., Lefort V., Anisimova M., Hordijk W., Gascuel O. New Algorithms and Methods to Estimate Maximum-Likelihood Phylogenies: Assessing the Performance of PhyML 3.0. Systematic Biology. 2010. V.59. P. 307–321. DOI: https://doi.org/10.1093/sysbio/syq010
3. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 1999. V.41. P. 95–98.
4. Komárková J., Jezberová J., Komárek O., Zapomělová E. Variability of Chroococcus (Cyanobacteria) morphospecies with regard to phylogenetic relationships. Hydrobiologia. 2010. V.639. P. 69–83. DOI: https://doi.org/10.1007/s10750-009-0015-3
5. Kotai J. Instructions for preparation of modified nutrient solution Z8 for algae. Norwegian Institute for Water Research, Blindern, Oslo. 1972. V.  11/69. 5 pp.
6. Kováčik L., Jezberová J., Komárková J., Kopecký J., Komárek J. Ecological characteristics and polyphasic taxonomic classification of stable pigment-types of the genus Chroococcus (Cyanobacteria). Preslia. 2011. V.83. P. 145–166.
7. Melekhin A.V., Davydov D.A., Borovichev E.A., Shalygin S.S., Konstantinova N.A. CRIS – service for input, storage and analysis of the biodiversity data of the cryptogams. Folia Cryptogamica Estonica. 2019. V.56. P. 99–108. DOI: https://doi.org/10.12697/fce.2019.56.10
8. Melekhin A.V., Davydov D.A., Shalygin S.S., Borovichev E.A. Obshchedostupnaya informatsionnaya sistema po bioraznoobraziyu tsianoprokariot i lishainikov CRIS (Cryptogamic Russian Information System) [CRIS (Cryptogamic Russian information systems): an open information system on biodiversity of Cyanoprokaryotes and lichens]. Byulleten’ Moskovskogo obshchestva ispytatelei prirody. Otdel biol. [Bull. Of Moscow Society of Naturalists. Biol. Ser.]. 2013. V.118, №6. P. 51–56. (in Russ.)
9. Nägeli C. Gattungen einzelliger Algen, physiologisch und systematisch bearbeitet. Neue Denkschriften der Allg. Schweizerischen Gesellschaft für die Gesammten Naturwissenschaften. 1849. V.10. P. 1–139.
10. Nübel U., Garcia-Pichel F., Muyzer G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl. Environ. Microbiol. 1997. V.63. P. 3327–3332. DOI: https://doi.org/10.1128/AEM.63.8.3327-3332.1997
    
11. Waterbury J.B. The Cyanobacteria – isolation, purification and identification. In: Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E.H. (eds.) The Prokaryotes. Third. Springer, New York, 2006. P. 1053–1073. DOI: https://doi.org/10.1007/0-387-30744-3_38
12. Wilmotte A., Van Der Auwera C., De Wachter R. Structure of the 16S ribosomal RNA of the thermophilic cyanobacteria Chlorogloeopsis HTF (‘Mastigocladus laminosus HTF’) strain PCC7518, and phylogenetic analysis. FEBS Lett. 1993. V.317. P. 96–100. DOI: https://doi.org/10.1016/0014-5793(93)81499-p

Authors

Davydov Denis A.

ORCID – https://orcid.org/0000-0002-0866-4747

Polar Alpine Botanical Garden Institute KSC RAS, Kirovsk, Russia;
Institute of the North Industrial Environmental Problems KSC RAS, Apatity, Russia

d_disa@mail.ru

Shalygin Sergei S.

ORCID – https://orcid.org/0000-0001-8886-6666

New Mexico State University, Las Cruces, USA

got.lifemusic@gmail.com

Vilnet Anna A.

ORCID – https://orcid.org/0000-0001-7779-2593

Polar Alpine Botanical Garden Institute KSC RAS, Kirovsk, Russia

anya_v@list.ru

Redkina Vera V.

ORCID – https://orcid.org/0000-0002-4908-5098

Institute of the North Industrial Environmental Problems KSC RAS, Apatity, Russia

kalmykova_v_v@mail.ru

ARTICLE LINK:

Davydov D.A., Shalygin S.S., Vilnet A.A., Redkina V.V. The morphological characteristic strain KPABG LID-610023 of Chroococcus s.l. group (Cyanoprokaryota). Voprosy sovremennoi algologii (Issues of modern algology). 2021. № 2 (26). P. 108–113. URL: http://algology.ru/1696

DOI – https://doi.org/10.33624/2311-0147-2021-2(26)-108-113

When reprinting a link to the site is required

Dear colleagues! If you want to receive the version of the article in PDF format, write to the editor,please and we send it to you with pleasure for free. 
Address - info@algology.ru

На ГЛАВНУЮ

Карта сайта

КОНТАКТЫ

Email: info@algology.ru

Изготовление интернет сайта
5Dmedia

ЛИЦЕНЗИЯ

Эл N ФС 77-22222 от 01 ноября 2005г.

ISSN 2311-0147